Bei der Array-CGH handelt es sich um eine molekulare Analyse des gesamten Genoms (Mensch, Maus, u.a.), mit der sehr kleine chromosomale Veränderungen (Mikrodeletionen und Mikroduplikationen, allerdings keine balancierten Chromosomenaberrationen) nachgewiesen werden können.

 

Vorteile der Array-CGH

Die hochauflösende Array-CGH-Analyse ist etwa 200mal sensitiver als die  herkömmliche mikroskopische Chromosomenanalyse. Sie erreicht - abhängig vom verwendeten Array - eine Auflösung von ungefähr 50 Kilobasen. Die herkömmliche  Identifikation struktureller Chromosomenaberrationen liegt oberhalb einer Größe von ca. 5-10 Millionen Basenpaaren.

 

Prinzip

Das Prinzip beruht auf einer Hybridisierung farblich markierter DNA an ein Raster von immobilisierten DNA-Fragmenten (Array), die bestimmten chromosomalen Regionen im Genom entsprechen.

Patienten (Probe) und Referenz DNA werden unterschiedlich markiert und gemeinsam auf den Array hybridisiert. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten jeder einzelnen Sonde gibt Aufschluss über die Kopienzahl der entsprechenden DNA. Die Regionen, wo die Testperson im Vergleich zur Kontrolle eine Deletion trägt, also ein Stück fehlt, leuchten später grün auf, die, wo ein Stück zuviel vorliegt (Duplikation) leuchten rot auf (siehe Abbildung).

 

 

Auswertung und Interpretation

Datenbankenrecherchen spielen eine große Rolle bei der Auswertung und Interpretation der Daten hinsichtlich der Lokalisation und Funktion der

• betroffenen Gene (http://genome.ucsc.edu/, www.omim.org, www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/),
• Copy number variations/ CNV-Auflistung (Toronto Database of Genomic Variants)
• klinischen Relevanz mittels DECIPHER und ECARUCA und weiteren.

 

Einsatzbereiche der Array-CGH

Die Array-CGH kommt als spezielle Untersuchungsmethode in verschiedenen Bereichen zum Einsatz. Dazu gehören: 

• Postnatale Diagnostik
• Tumorgenetik
• Maus-Modelle
• genomische Integrität von IPSCs

 

In der postnatalen Diagnostik dient die Array-CGH zur Diagnostik von Entwicklungsverzögerungen und Fehlbildungssyndromen. Submikroskopische Microdeletionen und Microduplikationen sind häufige Ursache für syndromale Erkrankungen, die meist mit Fehlbildungen und mentaler Retardierung einhergehen. Die Detektionsrate chromosomaler Aberrationen wurde mit dieser hochauflösenden Technologie deutlich verbessert. (1)
  

In der Tumorgenetik kommt die Array-CGH bei der Identifizierung wiederkehrender chromosomaler Veränderungen in bestimmten Gruppen von Tumoren (Tumorklassifizierung) zum Einsatz. Gene aus solchen Regionen spielen bei der Tumorentstehung und -entwicklung möglicherweise eine wichtige Rolle. Da chromosomale Veränderungen in vielen Tumoren, insbesondere Leukämien, klinische Relevanz haben, sind sie auch bedeutend im Hinblick auf die Stratifizierung und der Abschätzung der Prognose. (2-5)
  

In verschiedenen Maus-Modellen dient die Array-CGH zur Charakterisierung von Tumoren, beispielsweise nach retroviralem Gentransfer: Der Transfer von Vektoren, die stabil in das Zielgenom integrieren, ermöglicht die Korrektur eines defekten Gens. Allerdings birgt jede Integration in ein zelluläres Genom die Gefahr, Protoonkogene zu aktivieren und eine Leukämie zu induzieren. Mittels Array-CGH werden die so entstandenen Leukämien molekular untersucht, um beispielsweise Gene, die zur Leukämieentstehung beitragen, zu identifizieren.(6-8)

Die Array-CGH wird auch zur Kontrolle der genomischen Integrität von iPSCs eingesetzt, da sich herausgestellt hat, dass mit der Reprogrammierung eine erhöhte genetische Instabilität verbunden sein kann. 

Wir bieten die Methode daher für alle Forschungsgruppen an, die das Auftreten klonaler Chromosomenaberrationen überwachen möchten. (9-12)

 

Literatur

(1)  Gadzicki D, Baumer A, Wey E, Happel CM, Rudolph C, Tonnies H, Neitzel H, Steinemann D, Welte K, Klein C, Schlegelberger B. Jacobsen syndrome and Beckwith-Wiedemann syndrome caused by a parental pericentric inversion inv(11)(p15q24). Ann Hum Genet 2006; 70(Pt 6):958-964.
 
(2)  Tauscher M, Praulich I, Steinemann D. Array-CGH in childhood MDS. Methods Mol Biol 2013; 973:267-278.
 
(3)  Ripperger T, Tauscher M, Praulich I, Pabst B, Teigler-Schlegel A, Yeoh A, Gohring G, Schlegelberger B, Flotho C, Niemeyer CM, Steinemann D. Constitutional trisomy 8p11.21-q11.21 mosaicism: a germline alteration predisposing to myeloid leukaemia. Br J Haematol 2011; 155(2):209-217.
 
(4)  Praulich I, Tauscher M, Gohring G, Glaser S, Hofmann W, Feurstein S, Flotho C, Lichter P, Niemeyer CM, Schlegelberger B, Steinemann D. Clonal heterogeneity in childhood myelodysplastic syndromes--challenge for the detection of chromosomal imbalances by array-CGH. Genes Chromosomes Cancer 2010; 49(10):885-900.
 
(5)  Steinemann D, Skawran B, Becker T, Tauscher M, Weigmann A, Wingen L, Tauscher S, Hinrichsen T, Hertz S, Flemming P, Flik J, Wiese B, Kreipe H, Lichter P, Schlegelberger B, Wilkens L. Assessment of differentiation and progression of hepatic tumors using array-based comparative genomic hybridization. Clin Gastroenterol Hepatol 2006; 4(10):1283-1291.
 
(6)  Kustikova OS, Schwarzer A, Stahlhut M, Brugman MH, Neumann T, Yang M, Li Z, Schambach A, Heinz N, Gerdes S, Roeder I, Ha TC, Steinemann D, Schlegelberger B, Baum C. Activation of Evi1 inhibits cell cycle progression and differentiation of hematopoietic progenitor cells. Leukemia 2013; 27(5):1127-1138.
 
(7)  Manukjan G, Tauscher M, Ripperger T, Schwarzer A, Schlegelberger B, Steinemann D. Induced G1 phase arrest of fast-dividing cells improves the quality of genomic profiles generated by array-CGH. Biotechniques 2012; 53(4):245-248.
 
(8)  Heckl D, Schwarzer A, Haemmerle R, Steinemann D, Rudolph C, Skawran B, Knoess S, Krause J, Li Z, Schlegelberger B, Baum C, Modlich U. Lentiviral vector induced insertional haploinsufficiency of Ebf1 causes murine leukemia. Mol Ther 2012; 20(6):1187-1195.
 
(9)  Steinemann D, Gohring G, Schlegelberger B. Genetic instability of modified stem cells - a first step towards malignant transformation? Am J Stem Cells 2013; 2(1):39-51.
 
(10)  Didie M, Christalla P, Rubart M, Muppala V, Doker S, Unsold B, El Armouche A, Rau T, Eschenhagen T, Schwoerer AP, Ehmke H, Schumacher U, Fuchs S, Lange C, Becker A, Tao W, Scherschel JA, Soonpaa MH, Yang T, Lin Q, Zenke M, Han DW, Scholer HR, Rudolph C, Steinemann D, Schlegelberger B, Kattman S, Witty A, Keller G, Field LJ, Zimmermann WH. Parthenogenetic stem cells for tissue-engineered heart repair. J Clin Invest 2013; 123(3):1285-1298.
 
(11)  Grabundzija I, Wang J, Sebe A, Erdei Z, Kajdi R, Devaraj A, Steinemann D, Szuhai K, Stein U, Cantz T, Schambach A, Baum C, Izsvak Z, Sarkadi B, Ivics Z. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res 2013; 41(3):1829-1847.
 
(12)  Wu G, Liu N, Rittelmeyer I, Sharma AD, Sgodda M, Zaehres H, Bleidissel M, Greber B, Gentile L, Han DW, Rudolph C, Steinemann D, Schambach A, Ott M, Scholer HR, Cantz T. Generation of healthy mice from gene-corrected disease-specific induced pluripotent stem cells. PLoS Biol 2011; 9(7):e1001099.

 

24-Farben Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Die 24-Farben Fluoreszenz in situ Hybridisierung (24-Farben-FISH) wird in Ergänzung zur klassischen Bandendarstellung durchgeführt. Um fragliche Chromosomenaberrationen näher zu bestimmen sowie zur Identifizierung möglicher kryptischer Aberrationen wird diese Methode eingesetzt.

 

Abb. Karyogramm eines Patienten mit myelodysplastischem Syndrom und komplex aberrantem Karyotyp (4)

 

Literatur

Gohring G, Lange K, Atta J, Krauter J, Holzer D, Schlegelberger B. Cryptic t(15;17) in a patient with AML M3 and a complex karyotype. Cancer Genet.Cytogenet. 2007 Mai;175(1):77-80.
 
Gohring G, Karow A, Steinemann D, Wilkens L, Lichter P, Zeidler C, u. a. Chromosomal aberrations in congenital bone marrow failure disorders--an early indicator for leukemogenesis? Ann.Hematol. 2007 Okt;86(10):733-739.
 
Gohring G, Erlacher M, van Buiren M, Juttner E, Niemeyer C, Schlegelberger B. Mesenteric chloroma with t(16;16) followed by acute myelomonocytic leukemia with clonal evolution. Cancer Genet.Cytogenet. 2007 Dez;179(2):162-164.
  
Jädersten M, Saft L, Pellagatti A, Göhring G, Wainscoat JS, Boultwood J, u. a. Clonal heterogeneity in the 5q- syndrome: p53 expressing progenitors prevail during lenalidomide treatment and expand at disease progression. Haematologica. 2009 Dez;94(12):1762-1766.
  
Lange K, Gadzicki D, Schlegelberger B, Göhring G. Recurrent involvement of heterochromatic regions in multiple myeloma--A multicolor FISH study. Leukemia Research [Internet].  [zitiert 2010 Feb 19] In Press, Corrected Proof. Available from: www.sciencedirect.com/science/article/B6T98-4Y05429-1/2/d333b34687cd65d0618d78b42e00bd83
 
Gohring G, Schlegelberger B, Hellstrom-Lindberg E. Myelodysplastic syndromes. Molecular Diagnostics in Hematologic Oncology. Uni-Med Verlag Ag, 2008

Telomere stellen die Chromosomenenden dar und bestehen aus einer repetitiven DNA-Sequenz (TTAGGG). Die Aufgabe der Telomere besteht in einer Schutzfunktion der Chromosomen. Durch das sogenannte Enden-Replikationsproblem verkürzen sich die Telomere mit jeder Zellteilung. Bei Erreichen einer kritischen Länge unterliegt die Zelle im Normalfall der Apoptose. Die Telomerlängenverkürzung sowie die chromosomale Instabilität spielen eine wichtige Rolle im Rahmen der Leukämogenese. 

Die Telomerlängenmessung wird mittels der neu etablierten Methode Telomer/Zentromer-Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (T/C-FISH) in Kombination mit R-Bandenanalyse durchgeführt. Mit Hilfe dieser Methode können nicht nur die Telomerlängen der Zellen im Mittel sondern auch die Telomerlängen einzelner Chromosomenarme gemessen werden. Für diese Methode werden Metaphasen aus heparinisiertem Material benötigt.

Eine weitere Methode zur Telomerlängenmessung basierend auf einer RT-PCR wurde ebenfalls in unserem Institut etabliert.

a) Darstellung eines Neotelomerclusters in Chromosom 1 nach T/C-FISH-Analyse einer Patientin mit myelodysplastischem Syndrom.

b) und c) Karyogram der Patientin nach Fluoreszenz-R-Bandendarstellung

(b) und nach 24-Farben-FISH Analyse (c)

 

Literatur

Lange K, Holm L, Vang Nielsen K, Hahn A, Hofmann W, Kreipe H, u. a. Telomere shortening and chromosomal instability in myelodysplastic syndromes. Genes Chromosomes Cancer. 2010 März;49(3):260-269.
 
Cawthon RM. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method.
Nucleic Acids Res. 2009 Feb;37(3):e21.