Verwendete Methoden:

• Isolation primärer Fibroblasten, Kardiomyozyten und Enthothelzellen aus Maus
• Funktionelle Assays (Migration, Wundheilung)
• Signaltransduktion-Antikörper-Arrays
• Proteomics
• Fluoreszenz-, Konfokal-, Elektronen-Mikroskopie
• Generierung einer konditionellen Fibulin-6 knockout-Maus
• Myokardinfarkt im Mausmodell
• Echokardiographie im Mausmodell

Mittels Subtraktionshybridisierung haben wir in Mäusen nach Infarkt im heilenden Myokard Fibulin-6 als einen differentiell regulierten Kandidaten identifizieren können.

Fibuline stellen eine Familie von extrazellulären Proteinen dar, die mit Basalmembranen und elastischen Fibrillen assoziieren können und eine wichtige Rolle für die Interaktion von Zellen mit der extrazellulären Matrix und von Zellen untereinander spielen. Untersuchungen an Fibulin-1, -2 und -5 haben gezeigt, das Fibuline beim myokardialen Remodeling eine funktionelle Bedeutung haben.

In unseren eigenen Untersuchungen zeigte sich, dass Fibulin-6 nach Myokardinfarkt in Maus und Mensch differentiell reguliert wird und eine verstärkte Expression in der Infarkt-Remote-Zone aufweist. Im Verlauf des myokardialen Remodelings finden eine ganze Reihe von Auf- und Umbauprozessen innerhalb der extrazellulären Matrix statt, die im wesentlichen durch kardiale Fibroblasten gesteuert werden. So konnten wir in unseren Vorarbeiten zeigen, dass Fibulin-6 eine wichtige Rolle bei der Migration und der TGF-b vermittelten Differenzierung von kardialen Fibroblasten spielt. In unseren anstehenden Projekten soll nun die funktionelle Bedeutung von Fibulin-6 bei der Ausbildung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen, sowie bei der Regulation der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix während des myokardialen Remodelings untersucht werden.

Wir analysieren in vitro und in vivo wie Fibulin-6 myokardiale Umbauprozesse bei der Infarktheilung und dem maladaptiven Remodeling beeinflusst. Dazu setzen wir Fibulin-6 defiziente Mäuse in einem murinen Infarktmodell ein.

1. Chowdhury A., Herzog C., Hasselbach L., Loghmani H., Zhang J.,    Hammerschmidt M., Rudat C., Kispert A., Gaestel M., Menon M., Tudorache I., Hilfiker-Kleiner D., Mühlfeld C., Schmitto JD., Müller M., Theilmeier G. (2014) Expression of Fibulin-6 in failing hearts and its role for cardiac fibroblast migration. Cardiovasc Res 103(4):509-520
2. Chowdhury A., Hasselbach L., Echtermeyer F., Jyotsana N., Theilmeier G. Herzog C. (2017) Fibulin-6 regulates profibrotic TGF-b responses in neonatal mouse ventricular cardiac fibroblasts. Sci. Rep. Feb 17;7:42725

Verwendete Methoden:

• Isolation von PMNs aus Maus Knochenmark und humanem Blut
• Funktionelle Assays (Adhäsion, Transmigration, Chemotaxis)
• Nachweis von ROS, Apoptose, Nekrose
• Fluoreszenzmikroskopie
• Generierung einer konditionellen Nav1.3-vav-cre knockout-Maus
• Myokardinfarkt im Mausmodell
• Echokardiographie im Mausmodell
• Langendorff-Modell
• Nierenischämie-Mausmodell
• Patch-Clamp

Die Familie der spannungsabhängigen Natriumkanäle (Nav) beinhaltet 9 Mitglieder, die in Tetrodotoxin (TTX)-resistente (Nav1.5, 1.8, 1.9) und TTX-sensitive Kanäle (Nav1.1-1.4, 1.6) unterteilt werden. Die klassische Rolle von Nav-Kanälen ist die Erzeugung von Natrium-Einwärtsströmen, die den Aufstrich des Aktionspotentials in erregbaren Zellen generieren. Nav-Kanäle werden aber auch in nicht erregbaren Zellen wie Endothelzellen, Perizyten  und Makrophagen exprimiert, wobei ihre Funktion dort weitgehend unbekannt ist.

Die Untereinheit Nav1.3 wird hauptsächlich in embryonalen Stadien im ZNS exprimiert, jedoch auch in adulten sensorischen Neuronen nach Nervenverletzung und im adulten Herzen, wo sie für die Reizleitung und Pumpleistung eine wichtige Rolle spielt[1][1]. In unserem Projekt konnten wir zeigen, dass Nav1.3 im Myokardgewebe nach Ischämie hochreguliert wird und im Infarktgebiet eine deutliche Kolokalisation mit Ly6G-positiven Zellen (neutrophilen Granulozyten = PMNs) aufweist während Doppelfärbungen mit Makrophagenmarkern negativ ausfielen.

Bei den bisherigen Untersuchungen der funktionellen Rolle von Nav1.3 in PMNs zeigte sich, dass sowohl die pharmakologische Blockade als auch der Knock-out des Nav1.3 Natriumkanales zu einer reduzierten Adhäsion und Transmigration von PMNs auf Endothelzellen führt und auch die gerichtete Transmigration beeinflusst wird [2]. Diese Ergebnisse lassen darauf schliessen, dass Natriumkanäle wie Nav1.3 wichtige Funktionen im Rekrutierungsprozess der PMNs in inflammatorisches Gewebe haben. Für die detaillierte Analyse der Nav1.3 abhängigen Funktion bei der Rekrutierung von PMNs wurden Mäuse generiert, bei denen Nav1.3 spezifisch im hämatopoetischen System ausgeschaltet wurde (Nav1.3-vav-iCre/C57BL/6). Momentan untersuchen wir in vivo die Auswirkung einer Nav1.3-Defizienz auf die Myokardinfarktgröße, die PMN- Rekrutierung und das anschließende Remodelling im Maus-Myokardinfarktmodel.

Auf molekularer Ebene untersuchen wir zur Zeit, inwiefern Nav1.3 die Expression und Aktivierung von Selektinen, Integrinen und deren Bindungspartnern (ICAM, VCAM, PSGL-1) beeinflusst. In zukünftigen Projekten planen wir die Funktion von Nav1.3 in weiteren Organsystemen, wie Nieren- und Leberischämie, sowie am isolierten Mausherz im Langendorff-Modell zu untersuchen.

1. Poffers M, Buhne N, Herzog C, Thorenz A, Chen R, Guler F, Hage A, Leffler A, Echtermeyer F: Sodium Channel Nav1.3 Is Expressed by Polymorphonuclear Neutrophils during Mouse Heart and Kidney Ischemia In Vivo and Regulates Adhesion, Transmigration, and Chemotaxis of Human and Mouse Neutrophils In Vitro. Anesthesiology 2018, 128(6):1151-1166.

Verwendete Methoden:

• Isolation von Hepatozyten aus Maus und Mensch
• APAP induzierte Hepatotoxiziät mit Intervention in vitro und in vivo in WT und TRPV4 knockout-Mäusen
• Nachweis von ROS, Apoptose, Nekrose, Nitrotyrosilierung
• Expressionsanalyse RT-PCR, ELISA
• Messung von Leberenzymen
• Fluoreszenzmikrokopie

Hepatotoxizität ist eine gravierende Nebenwirkung bei einer Überdosierung mit Paracetamol (PCM). PCM wird in der Leber durch das Cytochrom P450-System zu N-Acetyl-p-benzochinonimin (NAPQI) verstoffwechselt, und dieser hochreaktive Metabolit gilt als hauptverantwortlich für die Hepatotoxizität, da er nach Depletion der Gluthationspeicher mit Proteinen reagiert und oxidativen Stress verursacht.

Dennoch sind die NAPQI-induzierten Mechanismen bislang schlecht verstanden, wobei kürzlich eine Rolle des Ionenkanals TRPM2 bei PCM-induziertem Leberschaden nachgewiesen werden konnte. In unseren bisherigen Arbeiten konnten wir zeigen, dass der Ionenkanal TRPV4 in Hepatozyten exprimiert wird und ein Target für NAPQI darstellt. Aus diesem Grund sind wir der Frage nachgegangen, ob TRPV4 eine Rolle bei der PCM-induzierten Hepatotoxizität spielt.

Bei unseren Untersuchungen stellte sich heraus, dass der TRPV4-Blocker HC067047 die PCM-induzierte Nekrose sowie die Entstehung von oxidativen Stress sowohl in murinen als auch in humanen Hepatozyten in vitro reduzieren kann. In vivo führt PCM, gemessen an den Leberenzymen ALT  und AST, zu einer geringeren Leber-schädigung in TRPV4-/--Mäusen im Vergleich zum Wildtyp. Auch histologisch sind Anzahl und Ausmaß der geschädigten Leberzellen um die Zentralvenen in TRPV4-/--Lebern im Vergleich zum Wildtyp deutlich erniedrigt, die Nitrierung von Proteinen durch Peroxinitrit vermindert sowie die Anzahl an rekrutierten neutrophilen Granulozyten nach einer PCM-Überdosierung in TRPV4-/--Mäusen reduziert. Unsere bisherigen Daten identifizieren TRPV4 als wichtige Komponente der PCM-induzierten Hepatotoxizität. Als Mechanismus scheint eine NAPQI-induzierte Aktivierung von TRPV4 mit einer konsekutiven Produktion von Peroxinitrit möglich [3].

In weiteren Studien untersuchen wir nun, ob sich TRPV4-Inhibitoren für die Behandlung der PCM-induzierten Hepatotoxizität im Mausmodell in vivo eignen. Dabei soll auch getestet werden, ob durch Gabe von TRPV4-Inhibitoren die Dosierung der herkömmlichen Therapie mit N-Acetylcystein vermindert werden kann und dies möglicherweise zu einem günstigeren Krankheitsverlauf führt.

1. Echtermeyer F, Eberhardt M, Risser L, Herzog C, Gueler F, Khalil M, Engel M, Vondran F, Leffler A: Acetaminophen-induced liver injury is mediated by the ion channel TRPV4. FASEB J 2019, 33(9):10257-10268.

Verwendete Methoden:

• Isolation von Makrophagen aus Maus und Mensch
• funktionelle Assays (Phagozytose, Transmigration, Chemotaxis)
• Patch-Clamp und Calcium-Imaging